Введение
Явление поглощения и последующего переизлучения света
поверхностями органических и неорганических образцов получило название «флуоресценция» или «люминесценция».
Это распространённое физическое явление. Флуоресценция приводит к испусканию
света в одно и то же время с поглощением возбуждающих световых лучей. Это
объясняется относительно малой временной задержкой между двумя процессами. Как
правило, испускание фотона происходит в микросекундном интервале после его
поглощения. Более длительный интервал именуется фосфоресценцией.
История
открытия флуоресценции
Первооткрывателем явления флуоресценции в середине XIX века стал британский учёный Джордж Стокс. Первым объектом исследований стал флюорит (плавиковый шпат). Было обнаружено испускание им красного цвета при ультрафиолетовом облучении. При этом длина испускаемой волны всегда превосходила длину поглощаемой. Позднее данный эффект был обнаружен при экспериментах с многими минеральными и органическими веществами.
Сдвиг Стокса
Когда электрон переходит от возбуждённого состояния к
основному, происходит потеря колебательной энергии. Следствием этого является
сдвиг испускаемых волн в сторону большей длины по сравнению с поглощаемыми.
Данный феномен получил название «сдвиг Стокса» в честь открывшего его
исследователя. Благодаря этому явлению разделение возбуждающего и испускаемого
света значительно облегчается, что находит применение в флуоресцентной
микроскопии.
Внедрение
флуоресценции в микроскопию
В 30-х годах прошлого века впервые стали применяться
флуорохромы – специальные флуоресцентные красители, воздействию которых
подвергаются при микроскопических исследованиях тканевые компоненты, бактерии и
т.д. Это привело к широкому применению флуоресценции в микроскопии.
Дальнейшее развитие метода до сих пор идёт по пути
создания применения всё более совершенных флуорофоров естественного и
синтетического происхождения. Для них характерны строго определённые
характеристики возбуждающего и испускаемого света в процессе флуоресценции, что
делает их более специфичными для лучшего обнаружения конкретных биологических
объектов.
Оказалось, что с применением флуоресцентного микроскопа
возможно даже обнаружение отдельных органических молекул. Флуоресцентное
мультиокрашивание различными красителями делают возможной одновременную
идентификацию нескольких молекул – так называемых «мишеней».
Несмотря на ограничение пространственного разрешения
вследствие специфического для каждого объекта дифракционного предела, применение
методов флуоресцентной микроскопии за этим пределом также возможно. Для многих
образцов характерно явление автофлуоресценции, т.е. самостоятельного свечения.
Для исследования таких объектов флуорохромы не требуются.
Как работает
флуоресцентный микроскоп
Флуоресцентный микроскоп действует по следующему
принципу:
- образец
облучается световыми волнами строго определённой длины;
- испускаемый
при этом видимый свет достигает наблюдателя.
Хорошо настроенный микроскоп с точно подобранными линзами
люминесцентных блоков направляет на человеческий глаз или в цифровую камеру
лишь испускаемые лучи. При этом наблюдаемый флуоресцирующий объект оказывается
на высоко контрастном тёмном или чёрном фоне. Предел возможностей
флуоресцентного микроскопа по обнаружению биологических структур определяется интенсивностью
затемнения нефлуоресцирующих объектов, т.к. яркость возбуждающего света
несравнимо выше, чем яркость испускаемого света.
Устройство
флуоресцентного микроскопа
Схема современного эпифлуоресцентного микроскопа,
предназначенного для использования как проходящего, так и отражённого света.
Основное его преимущество заключается в центральном вертикальном осветителе с
источником световых волн (люминесцентным модулем отраженного света с ртутным
или светодиодным источником света) в одной части, и насадкой с набором фильтров
(люминесцентный куб) – в другой.
В осветителе под действием фильтров происходит
преобразование многочастотного света, испускаемого дуговой лампой или другим
источником в световые волны определённой длины (как правило, это
ультрафиолетовый, синий или зелёный свет). Преобразованный свет, отражённый
дихроматическим (дихроичным) зеркалом, или светоделителем, при прохождении
сквозь стекло объектива интенсифицирует освещение образца. При флуоресцировании
освещаемого объекта происходят:
- концентрация
испускаемого света в объективе;
- отражение его дихроичным
зеркалом;
- фильтрация
испускаемых лучей с помощью запирающего, или эмиссионного фильтра.
Блоки
современного флуоресцентного микроскопа
·
Блок дуговой лампы занимает задний конец осветителя. В
флуоресцентной микроскопии, обычно используются ртутные или ксенонвые лампы,
однако в последнее время стали набирать популярность светодиодные осветители.
Они более долговечны, надежны и универсальны в использовании.
·
Волны исходящего
от лампы возбуждающего света проходят через несколько собирающих линз, а также
сквозь апертурную и полевую диафрагмы, регулируемые и центрируемые, после чего
оказываются на фильтре возбуждения, где отбираются волны необходимой длины.
·
В эпифлуоресцентных микроскопах обычно практикуется
объединение фильтра возбуждения, дихроичного зеркала и запирающего фильтра в
оптическом блоке, который образует так называемый куб. В современных
микроскопах, использующих флуоресценцию, размещается от 2 до 6 кубов. Для их
размещения, как правило, используется карусельная или выдвижная насадка.
Преимущества
эпифлуоресцентного освещения
Эпифлуоресцентное освещение, осуществляемое с помощью
вертикального осветителя, преобладает в современных микроскопических
исследованиях в силу очевидных преимуществ этого метода.
- Совмещая в
себе конденсор и собирающее испускаемый свет устройство в процессе
эпифлуоресцентного освещения, объектив всё время отлично юстируется.
- Возвращения
возбуждающего света на объектив почти не происходит.
- Есть
возможность комбинирования режимов наблюдения в лучах проходящего и
отражённого света, в том числе при формировании цифровых изображений.