Обзор методов световой микроскопии.

Методы освещения и наблюдения в микроскопии.

 Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, прошедших через различные участки препарата, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения в микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

Метод светлого поля.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов, у которых различные участки структуры по-разному поглощают свет (тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и другие). Пучок лучей из осветительной системы проходит препарат и объектив и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. Поглощающие элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет.

Метод косого освещения является разновидностью предыдущего, отличаясь тем, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. В ряде случаев это позволяет выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отраженном свете применяется для наблюдения непрозрачных объектов, к примеру, травленых шлифов металлов и различных минералов. Освещение препарата производится сверху, через объектив, который одновременно выполняет и роль осветительной системы. Изображение, как и при проходящем свете, создается за счет того, что разные участки препарата неодинаково отклоняют падающий на них свет, а отраженные лучи имеют различную интенсивность.

Метод темного поля в проходящем свете.

Метод тёмного поля в проходящем свете применяется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, невидимых при освещении по методу светлого поля.Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе создаётся лишь небольшой частью лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. При этом методе по виду изображения нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.Настройка микроскопа аналогична для микроскопов с различными типами освещения любого производства. Метод исследования в темном поле впервые был предложен австрийскими учеными Р.Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 г.

Наибольшее применение метод нашел для подсчета бактерий. Этот наиболее простой в реализации метод контрастирования. В темнопольном освещении объекты освещены световым кольцом, внутренний диаметр которого больше, чем диаметр поля зрения объектива. Таким образом прозрачные объемные объекты освещены вследствие рассеяния светового потока, а фон препарата остается не подсвеченным (темным).

Метод фазово-контрастной микроскопии.

Метод фазового контраста служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Другими словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Такое изображение называется фазово-контрастным.

Метод может быть реализован двумя способами

1. расположением элементов с фазовым и световым кольцами внутри оптических систем объектива и конденсора, соответственно;

2. расположением этих элементов вне объектива и окуляра внутри самого микроскопа.

Первый способ реализуется с помощью фазово-контрастных устройств, содержащих фазовые объективы и специальный конденсор с набором световых колец (встроенных в конденсор или выполненных в виде вкладышей). Приобретаются отдельно от микроскопа.

Второй способ реализуется с помощью соответствующих колец, которые устанавливаются в плоскости апертурной диафрагмы конденсора и в вынесенную с помощью дополнительных линзовых элементов плоскость выходного зрачка объектива. При этом и конденсор, и объектив — обычные. Чаще всего этот способ реализуется в современных инвертированных микроскопах.

 Фазовые объективы внутри имеют фазовый элемент (линза или пластина) с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца в среднем составляет 12—23 от диаметра выходного зрачка объектива при этом светопропуска-ние кольца — 10—30% в зависимости от типа фазового контраста.

 Фазовый конденсор в плоскости апертурной диафрагмы имеет пластину с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца, вернее его изображение, подбирается таким образом, чтобы оно соответствовало (или даже было чуть меньше) размеру фазового кольца объектива.


В типичной для этого метода схеме  в переднем фокусе конденсора 3 устанавливается апертурная диафрагма 2, отверстие которой имеет форму кольца. Её изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива 5, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка 6, на поверхности которой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, называемая фазовым кольцом. Фазовая пластинка может быть помещена и не в фокусе объектива (часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива), но в любом случае неотклонённые в препарате 4 лучи от осветителя 1, дающие изображение диафрагмы 2, должны полностью проходить через фазовое кольцо, которое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на l4 (l — длина волны света).

 


В то же время лучи, даже ненамного отклоненные (рассеянные) в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо (штриховые линии), и не претерпевают дополнительного сдвига фазы. С учётом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклоненными и неотклонёнными лучами оказывается близкой к 0 или l2, и в результате интерференции света в плоскости изображения 4' препарата 4 они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата. Отклоненные лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с неотклонёнными, поэтому ослабление основного пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения. Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля. Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с неотклонёнными через фазовое кольцо. Для подобных частиц фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.


 Метод инвертированной световой микроскопии.

 

Инвертированные микроскопы проходящего света представляют собой «перевернутую» конструкцию обычного микроскопа осветитель проходящего света расположен над объектом и имеет большое рабочее расстояние, тем самым обеспечивается свободный доступ инструмента (манипулятора, палочки, пипетки) к препарату, который находится, например, в чашке Петри. Специальные объективы установлены в револьверное устройство под предметным столиком. Объективы имеют большое и сверхбольшое рабочее расстояние по сравнению с обычными объективами, так как рассчитаны на работу с «покровным» стеклом (от 0,5 до 2,5 мм, иногда до 5 мм), которым является дно посуды, а также на работу в достаточно большом слое питательной среды в таком же диапазоне.


Метод флуоресцентной (люминесцентной) микроскопии.

Освещение объектов светом, возбуждающим люминесценцию, производится сверху через опак-иллюминатор и объектив. Современные люминесцентные микроскопы обычно являются вариантом модульной конструкции основной серии биологического микроскопа. Люминесцентный микроскоп отличается от биологического (проходящего света) наличием осветителя падающего (отраженного) света и дополнительных узлов, связанных со светофильтрами. В качестве источника света для люминесцентного осветителя используются ртутные лампы. При работе в свете люминесценции необходимо пользоваться только специальными люминесцентными объективами и нелюминесцирующими иммерсионными жидкостями (водная иммерсия и нелюминесцирующее масло).

При этом методе в оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта, либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами. Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.

Различают первичную флюоресценцию (собственной флюоресценцию, нередко проявляемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, некоторыми продуктами нормального и патологического обмена) и вторичную, или наведенную (возникает в результате поглощения объектом лучистой энергии).

Флуорохромы — красители, не вызывающие сильной окраски объектов в обычном свете, но флуоресцирующие при облучении ультрафиолетовыми лучами. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов.


Метод иммунофлуоресценции.

Иммуноцито-, гистохимические методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с антителам. Использование антител лежит в основе исследований самых разных молекулярных образований

? структурных компонентов клетки,

? клеточных продуктов (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов),

? рецепторов клеточной поверхности.

Для визуализации места связывания антигена с антителом используется целый ряд меток флуоресцентные красители, ферментные метки, металлы, металлопротеины, радиоизотопы.

Выделяют 2 метода иммунофлуоресценции.

1. Прямой метод. Визуализация тканевых антигенов производится непосредственным конъюгированием их с антителами известной антигенной специфичности. Этот метод появился первым и является низкочувствительным.

По методике специфические антитела метят флуоресцирующим красителем (например, акридиновым оранжевым), не меняющим их свойств, и «наносят» на препарат. Полученный препарат анализируют в люминисцентном микроскопе. При этом будут флуоресцировать только те участки препарата, которые содержат антиген. Исследуя с помощью иммунофлуорисценции образование комплекса антиген-антитело, для метки антител используют краситель, меняющий флуоресцентные свойства при соединении антител с антигеном.


2. Непрямой метод. Чувствительность иммуногистохимического окрашивания была значительно повышена с развитием непрямого способа. В непрямом методе в качестве первых антител используют немеченые антитела к клеточным антигенам а в качестве вторых – меченые флуорохромом антитела. В результате первые антитела соединяются с антигеном, а вторые – с первыми. Следует отметить, что при непрямом методе увеличивается чувствительность (усиливается окрашивание) и специфичность (способность связываться только с определенными антигенами) метода.

Типы антител

Моноклональные антитела. Получили свое название от того, что из одной клетки, производящей антитела к нужному антигену, получают целые колонии таких же клеток (моноклон). Клетки, которые производят одинаковые антитела к определенной опухоли, назвали «гибридомами». Они представляют собой уникальные природные «фабрики», способные в неограниченном количестве производить моноклональные антитела.

Моноклональные антитела вырабатываются клонами плазматических клеток. Антитела определенного клона иммунохимически идентичны и реагируют со специфическим эпитопом антигена, против которого они образованы. Возможно, по причине экономии, мышей принято использовать почти эксклюзивно для продукции моноклональных антител. После достижения иммунного ответа выделяют В-лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и соединяют их в специальных условиях с клетками несекретирующей мышиной миеломы. В то время как В-лимфоциты производят специфические антитела, клетки миеломы дают гибридные клетки (гибридомы), которые долго живут в культуральных условиях. Нереактивные В-клетки и клетки миеломы убирают и культивируют антителопродуцирующую гибридому, тестируя ее на желанную реактивность. Размножение можно проводить в культуре или трансплантацией гибридомы в брюшную полость сингенной мыши. Так можно получить большое и, по крайней мере теоретически, неограниченное количество моноклональных антител со специфическими характеристиками.

Таким образом, моноклональные антитела – это гомогенные антитела, продуцируемые гибридными клетками, в которых сочетаются способность синтеза специфических иммуноглобулинов одного изотипа с неограниченной пролиферацией. Методику получения таких гибридных клеток, иначе называемых гибридомами (hybridomas), разработали Дж. Колер и К. Мильштейн в 1975 г. В общих чертах она состоит в том, что лимфоциты иммунизированного животного, например, мыши, гибридизуются с культивируемыми в среде опухолевыми клетками, в данном примере — мышиными миелобластами; в процессе пассажей гибридом удается проводить отбор клонов, синтезирующих антитела с интересующей исследователя специфичностью. Главным преимуществом моноклональных антител является именно стандартная и воспроизводимая в пассажах специфичность в отношении конкретного эпитотипа (химическая структура на поверхности сложно построенного антигена; в силу особенности своей конфигурации способна взаимодействовать с комплиментарной ей структурой в составе антитела (паратопом), определяя тем самым специфичность данной серологической реакции).

Изобретение технологии получения МКА было отмечено в 1980 году Нобелевской премией. Оно, прежде всего, явилось мощным инструментом для научных исследований в области биологии, иммунологии и медицины и открыло широкие перспективы для создания новых диагностических и лечебных средств в онкологии. К настоящему времени получено громадное количество гибридом-продуцентов моноклональных антител к различным, в том числе к опухоле-ассоциированным антигенам.

Поликлональные антитела продуцируются различными клетками, и как следствие, иммуннохимически разнородны. Они реагируют с разнообразными эпитопами антигена, против которого они продуцированы. Наиболее часто используемое животное для получения поликлональных антител - кролик, далее следует козел, свинья, овца, лошадь, морская свинка и другие животные. В зависимости от иммуногенности антигена дозы от 10 до 200 мг часто употребляются для индукции иммунного ответа у животных. Антиген часто вводят внутри- или подкожно, однако также часто используют внутримышечные инъекции или инъекции в перитонеальную полость. У кроликов небольшие объемы (0,1-0,5 мл) обычно вводят внутрикожно; антиген разведен или суспензирован в равном объеме адъюванта, например таком как полный или не полный адъювант Фрэйда. Вспомогательную дозу постоянно раз в месяц или при уменьшении титра, увеличивает или поддерживает уровень антител. Кровь добывается из уха у кроликов, яремной вены (у больших животных) или из сердца, часто убийством животного. После удаления клеток, поликлональные антитела могут быть получены или в форме цельной стабилизированной антисыворотки, или разделено на фракции различной степени отчистки. Осаждение солями, после которой используется ионообменная хроматография, способствует удалению большей части других сывороточных протеинов. Афинная хроматография может быть использована для изотипии антигенспецифических антител и отделения их от перекрестнореагирующих антител к другим видам, особенно иммуноглобулинов человека.

Метод поляризационной микроскопии.

------------------


Метод конфокальной микроскопии.

Конфокальный микроскоп впервые был сконструирован в 1957г. Конфокальный микроскоп дает две неоценимые возможности - исследование тканей на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности и демонстрации результатов исследования (т.е. клеточной активности) в четырех измерениях - высота, ширина, глубина и время. Использование микроскопа дает возможность получения “оптических срезов” толстых полупрозрачных объектов без их препарирования.

 Метод наблюдения в УФ-лучах.

Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность микроскопа, т. е. понизить его предельное разрешение, которое зависит (см. выше) от длины волны ? применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ лучей ? = 400—250 нм, тогда как для видимого света ? = 700—400 нм). Но главным образом этот метод расширяет возможности микроскопических исследований за счёт того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в УФ области обладает, например, ряд веществ, содержащихся в растительных и животных клетках (пуриновые основания, пиримидиновые основания, большинство витаминов, ароматические аминокислоты, некоторые липиды, тироксин и др.); это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов цитохимического анализа. Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электронно-оптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Распространён следующий способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (например, синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.

Метод наблюдения в ИК-лучах.

Метод наблюдения в инфракрасных (ИК) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования или с помощью электронно-оптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например тёмных стекол, некоторых кристаллов и минералов и пр.