Люминесцентные микроскопы
Флуоресценция это разновидность фотолюминесценции. Некоторые вещества проявляют свойство - излучать более длинные световые волны (по сравнению с воздействующими) в ответ на их облучение светом с определенной специфической длиной волны (Стоксовское смещение). Излучение прекращается при отсутствии воздействия. Воздействующее облучение называется «возбуждающим светом» (excitation light), излучаемое в результате облучения возбуждающим светом свечение называют «излучаемым светом» (emitted light). Вещества, которые могут проявлять свойства флуоресценции, называют люминофоры, флуорохромы или флуорофоры.
Это свойство легло в основу создания методики микроскопических исследований материалов обычное окрашивание которых неэффективно, путем специфического связывания с ними флуоресцентных меток или материалов имеющих собственную автофлуоресценцию.
Рассмотрим принцип работы на комбинации Blue (B) флуоресцентного модуля микроскопа БиОптик BI-200 (рис. 1, диагр. 2):
Источником «возбуждающего света» служит ртутная лампа HBO (1), излучающая свет в широком волновом диапазоне с пиками интенсивности свечения в ультрафиолетовой (365нм), фиолетовой (405нм), синей (436нм), зеленой (546нм) и желтой (579нм) зонах спектра. Свет от лампы проходит через конденсор (2), в котором он собирается в плотный интенсивный пучок с максимально параллельным к оптической оси ходом. Затем свет проходит через «возбуждающий фильтр» (3), покрытие которого пропускает только свет с длиной волны менее 490 нм (см. диаграмму голубая линия). Затем свет (уже «обрезанный») попадает на дихроичное зеркало (6), покрытие которого отражает свет с диной волны менее 490 нм и пропускает свет с длиной волны более 490нм (см. диаграмму красная линия). Дихроичное зеркало (6) расположено под углом 45° к плоскости тыльной линзы объектива (5) и под таким же углом к плоскости линз конденсора, таким образом «возбуждающий свет» отражаясь от поверхности зеркала, попадает на тыльную линзу объектива (5) и, пройдя сквозь всю систему линз последнего, воздействует на исследуемый образец (4) связанный с флуоресцентным красителем.
Такая конструкция освещения «через объектив» или «конфокальное освещение» позволяет точечно освещать только исследуемый участок объекта, избегая выгорания флуорохромов в других местах окрашенного образца и минимизируя вредное воздействие ультрафиолетового света на окружающую среду, кроме того это единственно возможный способ при работе с большими увеличениями, когда расстояние между фронтальной линзой объектива и образцом исчисляется долями миллиметра и боковое освещение невозможно.
Диаграмма 2. Волновые характеристики системы Blue (B)
Под воздействием «возбуждающего света» флуорохромы начинают испускать «излучаемый свет», например, микобактерии туберкулеза (Mycobactérium tuberculósis) или палочки Коха, под воздействием синего «возбуждающего света» длиной волны 455нм начинают испускать желто-зеленое свечение в диапазоне от 500 до 650 нм. Более длинноволновый «излучаемый свет» падает на фронтальную линзу объектива (5) и, пройдя сквозь увеличительную систему последнего, попадает на дихроичное зеркало, которое, в силу своих свойств (см. диаграмму красная линия) полностью пропускает его. Пройдя через дихроичное зеркало, «излучаемый свет» попадает на барьерный фильтр, задача которого отсечь все артефактные свечения, которые могут возникать на образце и не иметь отношения к исследуемому объекту (грязь, свечение иммерсионного масла и пр.) или определить конкретную область интереса исследования свечения, в случае, когда это необходимо.
Существуют стандартные наборы (возбуждающий фильтр, дихроичное зеркало, барьерный фильтр), часто применяемые для рутинных лабораторных исследований. Так называемые «готовые решения» - для выявления возбудителей туберкулеза, бешенства, хламидиоза, анализа ДНК, работы с мечеными белками GFP и даже анализа битумных смесей. Тем не менее, многие исследователи предпочитают самостоятельно подбирать необходимые им для качественной работы наборы. Большинство производителей микроскопов предлагает массу фильтров и дихроичных зеркал для этих целей. Наиболее известные производители универсальных фильтров и зеркал, которые подходят к различным маркам микроскопов – CHROMA, OMEGA.
Пройдя через барьерный фильтр, свет попадает в тубусную систему (8) и затем формирует видимую увеличенную картинку светящихся объектов на окулярах (9) или на матрице подключенной к фотовыходу камеры.
